نور مرئی و فلورسانس

   جذب و بازتابش متعاقب نور توسط نمونه های ارگانیک و غیر ارگانیک اساسا ناشی از پدیده های فیزیکی همچون فلورسانس و فسفرسانس است. گسیل نور طی فرایند فلورسانس به جهت تاخیر نسبتا کوتاه مدت بین جذب و گسیل فوتون که معمولا کمتر از یک میکروثانیه است، تقریبا همزمان با جذب نور تحریک صورت می گیرد.

شرح

جذب و بازتابشمتعاقب نور توسط نمونه های ارگانیک و غیر ارگانیک اساسا ناشی از پدیده های فیزیکیهمچون فلورسانس و فسفرسانس است. گسیل نور طی فرایند فلورسانس به جهت تاخیر نسبتاکوتاه مدت بین جذب و گسیل فوتون که معمولا کمتر از یک میکروثانیه است، تقریباهمزمان با جذب نور تحریک صورت می گیرد.

دانشمند انگلیسی سر جورج جی. استاکسبرای نخستین بار در سال 1852 با مشاهده گسیل نور قرمز از فلوریت بر اثر تحریک توسطنور ماوراء بنفش این واژه را تعریف کرد. استاکس چنین بیان کرد که گسیل فلورسانسهمواره در طول موج بلندتری نسبت به نور برانگیختگی اتفاق می افتد. تحقیقات وبررسیهای اولیه در قرن نوزدهم نشان دادند که بسیاری از نمونه ها( شامل کانیها،کریستالها، رزینها، روغن، کلروفیل، ویتامینها و ترکیبات غیر آلی) زمانی نورفلورسانس از خود گسیل می کنند که در معرض تابش نور ماوراء بنفش قرار بگیرد. هرچند،از دهه 1930 به بعد بود که کاربرد فلوروکرومها در تحقییقات بیولوژیکی به منظور نشاندار کردن بافتها، باکتری و سایر پاتوژنها رواج یافت. برخی از انواع این نشانهابسیار خاص بوده و همزمان با پیشرفت میکروسکوپ فلورسانس گسترش یافتند.

تکنیکمیکروسکوپ فلورسانس از مهمترین ابزارهای کاربردی در علوم بیولوژیکی و بیوپزشکی ونیز علوم مواد به شمار می آید چراکه این میکروسکوپها مزایایی را دارند که در سایرشیوه های کنتراست با استفاده از میکروسکوپهای سنتی نوری دیده نمی شود. کاربرد یکآرایه از فلورسانسها امکان شناسایی سلولها و بافتهای سلولی فوق العاده کوچک را باویژگیهای بسیار خاص در میان ترکیبات غیر فلورسانسی میسر می سازد. در واقع،میکروسکوپ فلورسانس قابلیت آشکارسازی تک مولکولها را دارد. البته با استفاده ازبرچسب فلورسانس چندگانه ، ردیابهای مختلف قادر اند به طور همزمان چندین مولکول هدفرا شناسایی کنند. هرچندمیکروسکوپ فلورسانس نمی تواند تفکیک پذیری فضایی را در کمتراز حد پراش نمونه ها فراهم کند ، با این وجود آشکارسازی مولکولهای فلورسانس درپایینتر از چنین حدی به سهولت امکان پذیر است.

پدیده خود فلورسانس در بسیاری ازنمونه های متنوع، زمانی که در معرض تابش قرار می گیرند ،دیده می شود. پدیده ای کهبه طور گسترده در زمینه های مختلفی همچون گیاه شناسی، سنگ شناسی و صنایع مربوط بهنیمه رساناهابه کاربرده می شود. در مقابل، مطالعه بافتهای حیوانی و پاتوژنها غالبابا نور های فوق العاده کم و روشن و نیز خود فلورسانس نامعین بسیار دشوار است.هرچنددر مطالعات اخیر از فلورو کرومها ( که به آن فلوروفور نیز گفته می شود) نیز استفادهمی شود که توسط طول موجهای خاصی از نور تابشی تحریک شده و نور های با شدت معین ساتعمی کنند. فلوروکرومها که به طیفهای مرئی و مادون مرئی متصل می شود ، غالبا بازدهکوانتومی بالایی دارند( نسبت جذب فوتون به گسیل) . کاربرد میکروسکوپ فلورسانس همگامبا پیشرفتهای بیولوژیکی ،به دلیل ایجاد فلوروفورهای ترکیبی جدید با شدتهایبرانگیختگی و گسیل مشخص که به حالت طبیعی بوجود می آیند، رشد گسترده ای پیدا کردهاست.

اصول برانگیختگی و گسیل

از عملکردهای اصلی یک میکروسکوپ فلورسانس،روشن سازی نمونه ها با باند طول موجی خاص و مطلوب ودر مرحله بعد جداسازی فلورسانسگسیلیده بسیار ضعیف از نور تحریک است. در یک میکروسکوپ با ساختار مناسب ، تنها نورگسیلی است که می بایست به چشم و یا آشکارساز برسد. در ضمن معمولا تاریکی پس زمینهحدود آشکار سازی را کنترل می کند، و نور تحریک عموما چند صد هزار تا یک میلیون باراز نور فلورسانس گسیلیده روشنتر است.
در شکل 1 نمای نیم رخی از یک سیستم اپیفلورسانس مدرن در میکروسکوپ فلورسانس عبوری و انعکاسی نشان داده شده است. در یکانتهای سیستم روشنایی عمودی در قسمت مرکزی دستگاه ،منبع نوری و در انتهای دیگربرجکمکعبی فیلتر قرار گرفته است. این دستگاه از یک میکروسکوپ نوری انعکاسی پایه تشکیلشده که در ان طول موج نور بازتابی طولانی تر از نور تحریک است. ایجاد سیستمهایروشنایی فلورسانس درمیکروسکوپ فلورسانس نور بازتابی به نام Johan S. Ploemثبت شدهاست. در سیستم روشنایی عمودی فلورسانس ، نور با طول موج خاص ( ویا باند طول موجیمشخص) غالبا در طیف ماوراء بنفش و یا ناحیه آبی یا سبز طیف مرئی ، با عبور نور چندطیفی از لامپ و یا سایر منابع از یک فیلتر تحریک با طول موج انتخابی ایجاد می گردد. طول موجهایی که از فیلتر تحریک عبور می کنند ، از سطح یک آینه دو رنگ نما (کهدیکروییک نیز نامیده می شود) و یا شکافنده پرتو منعکس می شونند. چنانچه نمونه هافلوئورسان باشند و از خو نور ساتع کنند، این نور توسط عدسی جمع شده و با بازتابش ازسطح آینه دو رنگ نما به سطح فیلتر مانع( گسیل) برخورد کرده و فیلتر می شود. اینفیلتر در واقع مانع از عبور طول موجهای تحریک ناخواسته می گردد. لازم به ذکر است کهفلورسانس تنها شیوه در میکروسکوپ نوری است که طی آن نمونه ها، پس از تحریک ، از خودنور ساتع می کنند. نور ساتع شده مجددا در تمامی جهات بدون توجه به جهت منبع نورتحریک تابیده می شود.

میکروسکوپ اپی-فلورسانس از جمله پر قدرتترین تکنیکهایمیکرسکوپی نوین به شمار می آید. دراین میکروسکوپ سیستم روشنایی عمودی انعکاسی بینتیوبهای دید و محفظه رو دماغی (nosepiece)عدسی شیئی قرار گرفته است. نور تحریکابتدا از عدسی شیئی میکروسکوپ گذشته ( که در اینجا به عنوان یک کندانسور(عدسی محدب) عمل می کند) و به نمونه می تابد، در نهایت نور فلورسانس گسیل شده با استفاده ازهمان عدسی دریافت می شود. این نوع سیستم روشنایی دارای مزایای بسیاری است از جملهآنکه عدسی شیئی میکروسکوپ در ابتدا به عنوان یک کندانسور(عدسی محدب) و در مرحله بعدبه عنوان یک جمع کننده نور ایجاد کننده تصویر عمل می کند. از سوی دیگر، به عنوان یکسیستم واحد، عدسی شیئی/کندانسور همواره انطباق کاملی دارند. قسمت اعظم نور تحریکیکه به نمونه می رسد بدون رخداد هیچ گونه بر همکنشی از نمونه ها گذشته و از عدسی دورمی شود ، و سپس ناحیه روشن شده توسط عدسی چشمی دیده می شود( دراغلب موارد) . درنهایت، این روش امکان ترکیب و یا تناوب سازی بین مشاهده نور فلورانس انعکاسی ونیزدریافت تصاویر دیجیتالی را میسر می سازد.

همانطور که در شکل 1نشان داده شده است، سیستم روشنایی عمودی نور انعکاسی از یک محفظه لامپ arc-discharge در قسمت عقب ( که معمولا جیوه ای و یا زنونی است) تشکیل شده است. نورتحریک باگسیلش در راستای سیستم روشنایی عمود بر محور نوری میکروسکوپ از لنزهای جمعکننده و یک دریچه دیافراگم با قابلیت تنظیم و در نهایت یک دیافراگم زمینه (به شکل 1رجوع کنید) عبور می کند. این نور سپس به فیلتر تحریک رسیده و در آنجا باند طول موجیمطلوب انتخاب و از عبور طول موجهای ناخواسته جلوگیری میشود. طول موجهای انتخاب شده،پس از عبور از فیلتر تحریک، به آینه شکافنده اشعه دورنگ نما رسیده که به عنوان یکصافی تداخل ،طول موجهای کوتاه را بازتاب و طول موجهای بلند را عبور می دهد. اینآینه شکافنده اشعه دو رنگ نما نسبت به نور تحریک ورودی با زاویه 45 درجه قرار گرفتهو نور را بازاویه 90 درجه مستقیما به سمت عدسی شیئی و درنهایت نمونه منعکس می سازد. گسیل نور فلورسانس که توسط نمونه در معرض نور قرار گرفته ایجاد می شود ،بوسیله عدسیشیئی جمع شده و در نهایت توسط عدسی چشمی تصویر ایجاد شده دیده می شود. از آنجا کهنور گسیل شده در مقایسه با نور تحریک طول موج بلندتری دارد ،این نور قادر است تا ازآینه دورنگ نما و تیوبهای مشاهده و یا آشکارساز الکترونیکی عبور نماید.

اکثرنور تحریک متفرق شده که به آینه دو رنگ نما می رسد، به عقب به سمت منبع نوربازتابیده می شود، هرچند که مقدار ناچیزی ازآن غالبا عبورو توسط پوشش داخلی آینهجذب می گردد. پیش از انکه نور فلورسانس عبوری به عدسی شیئی و یا آشکار ساز برسد،ابتدا می بایست از فیلتر مانع عبور نماید. این فیلتر از عبور نور تحریک باقی ماندهجلوگیری کرده و نورهای گسیلی با طول موج بلندتر را عبور می دهد. در اغلب سسیستمهاینور انعکاسی، همانطور که در شکل 2 نشان داده شده است،فیلتر تحریک ،آینه دورنگ نما ونیز فیلتر مانع روی هم یک بلوک نوری را تشکیل می دهد( که غالبا مکعبی شکل است)میکروسکوپهای نوری نوین قادربه جا سازی 4 تا 6 مکعب فلورسانس (معمولا بر روی یکرولور گردان و از طریق یک مکانیسم لغزنده؛ شکل 1) اند و این ویژگی امکان جایگذاریسریع فیلترهای تحریک و مانع و نیز آینه های دورنگ نما را فراهم می سازد.

طراحیسیستم روشنایی عمودی می بایست به گونه ای باشد که امکان تنظیم میکروسکوپ برایروشنایی کهلر را میسر ساخته ویک دریچه روشنایی رادر میدان دید ایجاد نماید. از سویدیگر، لنزهای چگالنده اصلاح شده در سیستم نوری می بایست به گونه ای باشد که مشخصکند تصویر دریچه دیافراگم با روزنه عقب عدسی شیئی فوکوس توام است. در منابعنورمربوط به میکروسکوپهای نوین ، تصویر دریچه زمینه از پیش تنظیم شده با نمونهفوکوس شده ونیز سطح دیافراگم عدسی چشمی ثابت توام است.

محفظه لامپ منبع نورمعمولا ازیک فیلتر مانع نور مادون قرمز تشکیل شده است. محفظه لامپ می بایست به گونهای باشد که طول موجهای ماوراءبنفش را که بسیار مضر هستند از خود ساتع نکند و مجهزبه سوییچی باشد که اگر محفظه طی عملیات به طوراشتباه باز شد ، لامپ به طور اتوماتیکخاموش شود. استحکام این محفظه ها می بایست در حدی باشد که مقاومت کافی را در برابرانفجارهای احتمالی ( لامپ arc-discharge) داشته باشد. در محفظه های لامپ جدید ،سوکت لامپ مجهز به دکمه های قابل تنظیمی است که امکان تمرکز تصویر لامپ قوسی را درروزنه عقبی عدسی شیئی ( در سیستم روشنایی کوهلر، این صفحات توام هستند) فراهم میسازد. در نقاطی از مسیر نور، معمولا نزدیک به محفظه لامپ و در قسمت جلویی فیلترتحریک ، برای ممانعت کامل از عبور نور تحریک زمانی که نمونه توسط آشکارساز دیده نمیشود و تصویری از ان نیز به دست نمی آید ،وجود یک شاتر می تواند مفید وکمک کنندهباشد. علاوه براین برای انکه کاربر بتواند شدت نور تحریک را کاهش دهد ، می بایستتدارکاتی برای فیلترهای چگالی خنثی ( بر روی یک چرخ،رولور و یا لغزنده) در نظرگرفته شود.

جابجایی استوک

انرژی ارتعاشی زمانی تلف می شود که الکترنها ازحالت برانگیخته به حالت عادی باز می گردد. در نتیجه اتلاف انرژی ، طیف گسیلی یکفلوروفور برانگیخته معمولا در مقایسه با طیف جذب یا تحریک به طول موجهای بلندترتغییر می یابد (توجه داشته باشید که طول موج به طور معکوس به انرژی تابشی تغییر مییابد) که این پدیده قانون استوک یا جابجایی استوک نامیده می شود. با افزایش مقدارجابجایی استوک ، با استفاده از ترکیبات فیلتر فلورسانس ، جداسازی نور تحریک از نورگسیلی تسهیل می گردد.

پیک شدت نور گسیلی (یا جذب ) فلوروفور معمولا کمتر از طولموج و بزرگی پیک تحریک است و منحنی طیفی نور گسیلی غالبا تصویر اینه ای(یا نزدیک بهآن) است ازمنحنی تحریک، با این تفاوت که طول موجهای آن بلندتراست. همانطور که درشکل 3 برای Alexa Fluor 555 آمده است، این سیستم یک ردیاب مفید است که نور را درناحیه زرد-سبز جذب نموده و نورهای گسیلی به رنگ زرد-نارنجی را ایجاد می کند. برایافزایش شدت نور فلورسانس به حداکثر میزان، یک فلوفور( که معمولا رنگ نامیده میشود)معمولا در طول موجهایی نزدیک به پیک منحنی تحریک برانگیخته و وسیعترین محدودهممکن از طول موجهای گسیلی را که شامل پیک گسیل می گردد ،ایجاد می کند. انتخاب طولموجهای تحریک و گسیلی معمولا براساس فیلترهای تداخل صورت می گیرد(شکل 2).گذشتهازاین، واکنش طیفی یک سیستم نوری میکروسکوپی معمولا به فاکتورهایی همچون بازدهیانتقالی شیشه ای( به دلیل وجود پوششهای ضد انعکاس) ، تعداد لنزها و اجزای آینه ای ونیز سرعت عکس العمل سیستم اشکارساز بستگی دارد.

جداسازی و آشکارسازی موثر طولموجهای تحریک و گسیلی در میکروسکوپهای فلورسانس با انتخاب مناسب فیلترهایی که برایعبور و یا ممانعت از عبورباندهای طول موجی خاص در طیف ماوراء بنفش،مرئی،و زیر قرمزنزدیک مورد استفاده قرار می گیرد، انجام می شود. منابع نور عمودی فلورسانس با هدفکنترل نور تحریک با جوف گذاری فیلترهای با قابلیت تعویض آسان ( متعادل کننده هایچگالی خنثی و نیز تحریک تداخل ) در مسیر نور به سمت نمونه و مجددا در مسیر بیننمونه و تیوبهای مشاهده و یا سیستمهای آشکارساز دوربینی طراحی شده است. شایدمهمترین فاکتور در نورهای گسیلی فلورسانس با شدت نسبتا پایین ان است که منبع نوریکه برای تحریک مورد استفاده قرار می گیرد،از روشنایی کافی برخوردار باشد تا بدینترتیب شدت نور گسیلی به حد ماکزیمم رسیده و فلوروکرومها از خواص جذبی و بازده ایکوانتومی گسیلی کافی برخوردار باشد.

راندمان جذب یک فوتون توسط یک فلوروفور خاصبه مقطع عرضی مولکولی بستگی دارد و میزان احتمال جذب آن ضریب جذب نامیده می شود. هرقدرکه ضریبهای جذب بیشتر باشد، احتمال جذب یک فوتون (کوانتوم)در ناحیه طول موجیمشخص بیشتر خواهد بود. بازدهی کوانتومی در واقع نسبت تعداد کوانتومهای گسیل شده رابه کوانتومهای جذب شده ( معمولا بین 0.1 تا 1.0) نشان می دهد. بازدهی کوانتومی کمتراز 1 ناشی از اتلاف انرژی در مسیرهای غیر تابشی نظیر واکنشهای فوتوشیمیایی و یاحرارتی است. ضریب جذب و بازدهی کوانتومی که در واقع نشان دهنده شدت روشنایی منبعنور استو نیز دوام فلورسانس همگی از فاکتورهای مهمی هستند که بر شدت و استفاده ازگسیل نور فلورسانس تاثیر می گذارد.

محوسازی، فرونشانی و سفید سازیتصویر

شرایط طیفی گسترده ای بر گسیل فلورسانس بازتابش تاثیر می گذارد واز شدت آنمی کاهد. محوسازی واژه ایست که برای کاهش شدت گسیل فلورسانس مورد استفاده قرار میگیرد. سفیدسازی تصویر در واقع تجزیه غیر قابل تغییر مولکولهای فلورسانت در حالتبرانگیختگی آنهم به جهت برهمکنش با اکسیژن مولکولی پیش از گسیل می باشد. بازیافتفلورسانس پس از سفیدکاری تصویر (FRAP) ،از مکانیسمهای بسیار مفید برای بررسی تفرق وحرکت ماکرومولکولهای بیولوژیکی به شمار می اید. در این شیوه ،ناحیه مشخصی از نمونهدر معرض نور لیزری قرارمی گیرد. تکنیک کنترل اتلاف فلورسانس در سفید سازیتصویر(FLIP)برای تعیین میزان کاهش نور فلورسانس در یک ناحیه مشخص نزدیک به ناحیهسفید سازی شده به کاربرده می شود. مشابه با FRAP، تکنیک دوم نیز برای تعیین میزانتحرک و پویایی مولکولی در سلولهای زنده مورد استفاده قرار می گیرد.

در شکل 4 مثال مشخصی از سفید سازی تصویر اورده شده (محوسازی) است ،با ارائه تصاویردیجیتالی که در زمانهای مختلف از سلولهای فیبروبلاست اپیدرمیس آهوی Indian Muntjac تهیه شده است. هسته ها توسط bis-benzimidazole (Hoechst 33258؛ فلورسانس آبی رنگ  میتوکندریها و آکتین کیتواسکلتون توسط یک MitoTracker Red CMXRos فلورسانس قرمز) وفالوئیدین توسط Alexa Fluor 488 فلورسانس سبز به ترتیب بی رنگ می شوند. در اینروش،وقفه های زمانی دو دقیقه ای با استفاده از یک فیلتر فلورسانس با پهناهای باندمتفاوت به گونه ای در نظر گرفته شده اند که سه فلوروفور به طور همزمان تحریک وسیگنالهای گسیلی را ثبت شونند. توجه داشته باشید که سه فلوروفور در شکل (a)4، شدتنسبتا بالایی دارند، اما شدت فلوروفور Hoechstآبی ظرف مدت دو دقیقه به شدت کاهشیافته به گونه ای که ظرف 6 تا 8 دقیقه به طور کامل از بین می رود. میتوکندری واکتینها در برابر سفیدسازی تصویر بسیار مقاوم اند،اما شدت آن به میزان زیادیدرتوالیهای دوره ای کاهش می یابد(10 دقیقه ای). فرونشانی حالت برانگیختگی منجربه کاهش شدت نور فلورسانس طی مکانیسمهای مختلفی همچون اتلاف انرژی غیر رادیواکتیومی گردد و غالبا بر اثر فاکتورهای اکسیداسیون مختلف و در حضور نمکها ،فلزات سنگین ویا ترکیبات هالوژنی رخ می دهد. در برخی موارد ، این فرونشانی ناشی از انتقال انرژیبه سایر مولکولهایی( که پذیرنده نامیده می شود) است که از نظر موقعیتی به فلوروفوربرانگیخته( دهنده) نزدیک هستند . این پدیده به عنوان انتقال انرژی رزونانس فلورسانس (FRET)نامیده می شود که عنوان مبنای تکنیکهای مختلفی به شمار می آید که به مطالعهبرهمکنشهای مولکولی با تفکیک پذیری افقی بسیار پایین می پردازد.

منابع نورفلورسانس

یکی از پیامدهای منفی سطوح گسیل پایین ،تعداد بسیار کم فوتونهایی استکه به چشم و یا آشکارساز دوربین می رسد. در اغلب موارد ، بازدهی تمرکزمیکروسکوپهاینوری کمتر از 30 درصد و تمرکز بسیاری از فلوروفورها در مسیر نوری در حد میکرومولارو نانومولار است. به منظور ایجاد شدت نور تحریک کافی با گسیلش قابل شناسایی،منابعنور کوچک و در عین حال قوی مانند لامپهای پرانرژی arc-discharge مورد نیاز است. متداولترین نوع این لامپهاعبارت اند از:لامپهای جیوه ای با ولتاژبین 50 تا 200 واتو لامپهای زنونی بین 75 تا 150 وات ( شکل 5). این منابع نور معمولا توسط یک منبعجریان مستقیم بیرونی تغذیه می شود که قدرت کافی را برای روشن سازی در حینیونیزاسیون بخار و نیز تداوم بدون کمترین میزان لرزش را دارا هستند.

منبعتغذیه بیرونی لامپ arc-discharge میکروسکوپ معمولامجهز به تایمری است که تعدادساعات کار کرده را نشان می دهد. بازدهی این لامپها ،در صورتی که بیش از طول عمرارزیابی شده (200 تا 300 ساعت) مورد استفاده قرار گیرند، کاهش یافته و حتی احتمالترکیدن آنها نیز می رود. شدت لامپهای جیوه ای در رینج طیفی بین ماوراء بنفش تامادون قرمزناچیز است و بیشترین میزان شدت ان مربوط به طیف نزدیک به ماوراء بنفش استبه گونه ای که حداکثر پیکهای شدت در حدودهای 313،334،365، 406، 435، 546 و 578نانومتردیده می شود. در طول موجهای دیگرمربوط به ناحیه نور مرئی، میزان شدت نورثابت اما چندان روشن نیست( اما در موارد بسیاری کاربرد دارد). در بازدهی روشنایی،تنها توان لامپ به عنوان یک فاکتور تعیین کننده به شمار نمی آید، بلکه روشناییمتوسط به عنوان یکی از اصلیترین پارامترها در کنار پارامترهای دیگری همچون روشناییمنبع و نیز سرعت زاویه ای گسیل محسوب می گردد.

طی دو سال گذشته، استفاده ازمنابع نور لیزری خصوصا لیزرهای آرگون-یون و آرگون-کریپتون(یون) در میکروسکوپی نوریکاربرد چشمگیر و گسترده ای پیدا کرده است. از جمله ویژگیهای این لیزرها می توان بهمنابع نور کوچک، میزان واگرایی کم، تقریبا تک کرومیوم و نیز روشنایی متوسط بالا رانام برد. کاربرد این منابع نوری خصوصا اهمیت بسیاری در میکروسکوپی همکانون پویشیپیدا کرده و به عنوان یک ابزار قدرتمند در پرداخت تصاویر فلورسانس با وضوح بالامطرح شده و این امربا رد نور غیر فوکوس که ازصفحه کانونی نمونه دور می شود ،انجاممی گیرد. میکروسکوپهای همکانون این کار را با پویش نقطه ای ویا خطی همزمان باتصویربرداری و از طریق یک دریچه مزدوج انجام می دهد. بخشهای نوری نمونه ها را میتوان در یک کامپیوتر میزبان ذخیره وبه این ترتیب تصویر نهایی را از نو ایجاد و درنهایت بر روی مانیتور نشان داد.
اصطلاحات فنی متداولی که دررابطه بافیلترهای میکروسکوپ فلورسانس به کاربرده می شود به دلیل دارابودن کدهها و حروفابتدایی متفاوتی که در مورد هر اصطلاح توسط تولید کنندگان مختلف به کاربرده می شود،بسیار گیج کننده هستند. اساسا فیلترها به سه دسته تقسیم می شونند: تحریک( غالبا بهعنوان تحریک کننده ها مطرح می شونند)، مانع(گسیل) و فیلترهای شکافنده اشعه دو رنگنما( آینه های دو رنگ نما). فیلترهای فلورسانس پیشتر از گاز رنگ شده ویا ژلاتینی کهبین دو صفحه شیشه ای قرار می گرفت، ساخته می شد. اما در حال حاضر تمایل سازندگانبیشتر به سمت تولید فیلترهای با تفکیک بالا به همراه اپتیکهای تداخلی فیلترهایتحریک بیشتر شده است که این فیلترها موجب عبور و یا انعکاس نور با طول موجهای خاصمیشوند،البته زمانی که در مسیر نور با زاویه 45 درجه قرار گیرد (مراجعه به شکل 1 و 2). فیلترهای مانع از شیشه رنگی و یا روکشهای تداخل (یا ترکیبی از هردو ) ساخته شدهاست.

اختصاراتی که توسط تولیدکنندگان برای شناسایی خواص فیلترهای تحریک بهکاربرده می شود عبارت اند از: UG (شیشه ماوراء بنفش) و BG (شیشه آبی). فیلترهای Shortpass غالبا به صورت KP ( K مخفف کلمه kurz،به معنای \"کوتاه\" در زمان آلمانیاست) و یا به سهولت به صورت SP مشخص می شود. برخی تولیدکنندگان، فیلترهای تداخل رابا علامت اختصاری IF نشان می دهند. البته استفاده فیلترهای تداخل تحریک باند کوتاه،خصوصا چنانچه جابجایی استوک کم باشد ،بسیار مفید و کارامد خواهند بود.

سرنامهایا اختصاراتی که در فیلترهای مانع مورد استفاده قرار می گیرد عبارت اند از: LP یا L در فیلترهای با باند بلند ، Y یا GG درشیشه های زرد یا gelb(آلمان) ، Rیا RG درشیشه قرمز،OG یا O در شیشه نارنجی، K (نوعی واژه المانی مخفف کلمه kante )درفیلترلبه ای و BA در مورد فیلترهای مانع به کار برده می شود.

اصطلاحات فنیمتداولی که دررابطه با فیلترهای میکروسکوپ فلورسانس به کاربرده می شود به دلیلدارابودن کدهها و حروف ابتدایی متفاوتی که در مورد هر اصطلاح توسط تولید کنندگانمختلف به کاربرده می شود ،بسیار گیج کننده هستند. اساسا فیلترها به سه دسته تقسیممی شونند: تحریک( غالبا به عنوان تحریک کننده ها مطرح می شونند)، مانع(گسیل) وفیلترهای شکافنده اشعه دو رنگ نما( آینه های دو رنگ نما). فیلترهای فلورسانس پیشتراز گاز رنگ شده ویا ژلاتینی که بین دو صفحه شیشه ای قرار می گرفت، ساخته می شد. امادر حال حاضر تمایل سازندگان بیشتر به سمت تولید فیلترهای با تفکیک بالا به همراهاپتیکهای تداخلی فیلترهای تحریک بیشتر شده است که این فیلترها موجب عبور و یاانعکاس نور با طول موجهای خاصمی شوند،البته زمانی که در مسیر نور با زاویه 45 درجهقرار گیرد (مراجعه به شکل 1 و 2). فیلترهای مانع از شیشه رنگی و یا روکشهای تداخل (یا ترکیبی از هردو ) ساخته شده است.

اختصاراتی که توسط تولیدکنندگان برایشناسایی خواص فیلترهای تحریک به کاربرده می شود عبارت اند از: UG (شیشه ماوراءبنفش) و BG (شیشه آبی). فیلترهای Shortpass غالبا به صورت KP ( K مخفف کلمه kurz،بهمعنای \"کوتاه\" در زمان آلمانی است) و یا به سهولت به صورت SP مشخص می شود. برخیتولیدکنندگان، فیلترهای تداخل را با علامت اختصاری IF نشان می دهند. البته استفادهفیلترهای تداخل تحریک باند کوتاه ،خصوصا چنانچه جابجایی استوک کم باشد ،بسیار مفیدو کارامد خواهند بود.

سرنامها یا اختصاراتی که در فیلترهای مانع مورد استفادهقرار می گیرد عبارت اند از: LP یا L در فیلترهای با باند بلند ، Y یا GG درشیشه هایزرد یا gelb(آلمان) ، Rیا RG در شیشه قرمز،OG یا O در شیشه نارنجی، K (نوعی واژهالمانی مخفف کلمه kante )در فیلترلبه ای و BA در مورد فیلترهای مانع .

فیلترهای شکافنده اشعه دورنگ نما نیز با مخففهای مختلفی نشان داده می شوندنظیر CBSبرای یک شکافنده اشعه دورنگ نما ، DM برای آینه دورنگ نما، TK برای \"teiler kante\"، واژه آلمانی که به معنای صافی چاکدا ر است، FT برای \"farb teiler\" (واژهآلمانی که به معنای شکافنده رنگ است)و RKP برای باند کوتاه انعکاس. تمامی این واژهها می بایست قابل تغییر باشد ، در حال حاضر شکافنده های اشعه دورنگ نمای جدید باپوششهای تداخل بر روی شیشه نوری ساخته می شود( در مقابل رنگهای متالیک یا ارگانیک). البته فیلمهای کوچک تداخل برای ایجاد بازتاب پذیری بالا در طول موجهای کوتاه ونیزانتقال با سرعت بالا در طول موجهای بلندتر طراحی شده اند. شکافنده های طول موجدورنگ( نما) با وضعیت قرار گیری در حالت زاویه 45 درجه در مسیر نور تحریک ، مانعهاینوری را مسیر نور فلورسانس بازتاب شده ایجاد می کند که عملکرد اصلی آنها تغییر جهتطول موجهای (کوتاه تر) تحریک انتخاب شده به سمت عدسی شیئی و در نهایت نمونه است. ازدیگر ویژگیهای این فیلترها می توان عبورنور فلورسانس با طول موج بلندتر و بازتابنورهای تحریک تفرق یافته به عقب و به سمت محفظه لامپ را نام برد .

درنمودار شکل 6 ،منحنیهای انتقال در یک فیلتر فلورسانس خاص در سیستمهای میکروسکوپی جدید نشان دادهشده است. طیف امواج فیلترتحریک (منحنی قرمز) سطح انتقال بالایی را (تقریبا 75 درصد) در حدود بین 450 تا 490 نانومتر با طول موج مرکزی(CWL) 470 نانومترایجاد می کند. اینه دورنگ (منحنی زرد) طول موجهای ناحیه طیف تحریک را منعکس می سازد ،حال انکه طولموجهای بلندتر و کوتاهتر با راندمان نسبتا بالاتری منعکس می گردد. توجه داشته باشیدکه انتقال صفر درصدی درمنحنی اینه دورنگ نما مطابق با انعکاس 100 درصدی است. شیبقابل توجه در منحنی انتقال بین حدود 450 تا 500 ، که نشانگریک پیک انعکاسی است،برای انعکاس طول موج باندهایی که از فیلتر تحریک با زاویه 90 درجه عبور وبه نمونهمی رسد،به کاربرده می شود. قسمت انتهایی این سیستمها فیلتر مانع یا گسیلی ( منحنیسفید) است که موجب انتقال طول موجها در ناحیه نور مرئی سبز درحدود بین 520 تا 560نانومتر می گردد.
محدوده های بین باندهای طول موجی انتقالی و انعکاس به گونه ایاست که شیب ان برای جداسازی تقریبا کامل طول موجهای بازتابی و انتقالی کافی است. الگوی تابیدگی بالا و پایین اسپایکها که در طیف امواج اینه دورنگ(نما) دیده می شوداز مهمترین تاثیرات این فرایند به شمار می آید. عملکرد این ترکیب فیلتری چشمگیر ونوعی دمونستراسیون اشکارآن ازجمله پیشرفتهای است که در تکنولوژی فیلتر تداخل بااستفاده از فیلمهای نازک صورت گرفته است.
فهرست واژه ها و اصطلاحات فیلتر کهتوسط نیکون به کاربرده شد، ازمجموعه واژگانی مشتق شده که کاربرد آن به اوایل دهه 1990 بازمی گردد. دران زمان، تمامی ترکیبات فیلتری متممی نیکون با کمک تکنیک اسپاتربا پوششهایی از جنس سخت ایجاد شدند ، اما دربسیاری از فیلترهای در دسترس متداول ازشیوه های پوششی نرمتراستفاده می شود. از جمله ویژگیهای پوششهای نرم آن است که نسبتبه کاهشهای دمایی و رطوبتی حساستر اند ولذا می بایست با در مقایسه با فیلترهای باپوشش سخت با دقت بیشتری از آنها استفاده کرد.اگاهی از فهرست واژه ها و لغات کدفیلتر نیکون مکانیسمی را برای تعیین سریع اینکه آیا مجموعه به قدر کافی برای یکفلورورخاص کاربرد دارد یا خیر،کمک می کند.
نخستین حرف در کد نامگذاری حرفی -عددی اختصاصی در فیلترها ناحیه طیفی تحریک طول موجی( برای مثال UV, V, B و G که بهترتیب اختصارات ساده ای برای طول موج ماوراء بنفش، بنفش، آبی و سبز می باشد)را نشانمی دهد. از سوی دیگر، رقمی که پس از کد تحریک قرار می گیرد ،به پهنای نوار گذرفیلترتحریک بستگی دارد: 1 برای تحریک باند کوتاه، 2 برای تحریک باند عرض و متوسط و 3برای تحریک باند بسیار عریض. در نهایت، یک یا دو حرفی که پس از رقم مربوط به اندازهنوار گذر تحریک قرار می گیرد ،ویژگیهای فیلترمانع را مشخص می سازد. کد A نشان دهندهیک فیلتر مانع با نوار گذر استاندارد با کمترین طول موج است، حال آنکه کدB طول موجبالاتری را برای یک فیلتر گسیل با نوار گذر طولانی تر نشان می دهد. فیلترهای گسیلنوار گذر با حرف E (به معنای \"افزایش یافته\") مشخص می شونند . فیلترهای E/C ،واحدهای تداخل با پوشش نرم است که برای بهبود کارایی در ردیابهایی همچون DAPI, FITC, TRITC و Texas Red.طراحی شده اند.

میکروسکوپ نوری از آنجا که ازنورهای مرئی برای شناسایی اجسام کوچک استفاده می کند ، از جمله متداولترین وپرکاربردترین ابزارهای تحقیقاتی در مطالعات بیولوژیکی به شمار می آید. هرچند هنوزهم بسیاری از دانش آموزان و معلمان از مزایای میکروسکوپهای نوری به طور کامل اگاهنیستند. از آنجا که بسته به کیفیت و نیز چند کاربری بودن میکروسکوپ ،قیمت اینمیکروسکوپها نیزافزایش می یابد، لذا کاربران برنامه های آکادمیک نمی توانند از آنهااستفاده کنند. انواع گرانقیمت این میکروسکوپهای نوری تصاویر جالبی را در اختیاردانش اموزان قرار داده و تجارب آنها را نیز افزایش می دهد.
بزرگترین چالشهایی کهیک تازه کاردرحین مشاهده اجسام ریز توسط میکروسکوپها با بزرگنمایی مناسب برخورد میکند عبارت اند از:

•دستیابی به کنتراست مطلوب

•یافتن صفحه کانونی

•دستیابیبه تفکیک پذیری ایده ال

•تشخیص نمونه زمانی که توسط میکروسکوپ مورد مطالعه قرارمی گیرد.

از این میکروسکوپها برای مشاهده اجسام بسیار ریز همچون باکتریهابا بزرگنمایی 100x استفاده می شود. البته این اجسام توسط میکروسکوپهای زمینه روشنقابل مشاهده نیستند. در ادامه به شرح انواع اپتیکهایی که برای دستیابی به کنتراستمطلوب مورد استفاده قرار می گیرد،همین طورارائه روشهایی برای یافتن و نیز فوکوس برروی نمونه وارائه روشهایی برای استفاده ازابزارهای اندازه گیری توسط میکروسکوپ نوریپرداخته می شود